---

هدف: ویروس هپاتیت Cیکی از مهمترین عوامل ایجاد کننده هپاتیت ویروسی به شمار می‌رود و تشخیص آن در نمونه‌های مشکوک از اهمیت بالایی برخوردار است. خطر انتقال عفونت ویروسی از طریق تزریق خون و فرآورده‌های آن ناشی از نقص روش‌های غربالگری سرولوژیک در تشخیص اهداکنندگان آلوده‌ای است که در دوره پنجره بیماری هستند. بنابراین تشخیص دقیق و به‌موقع عفونت HCVپیش از ظهور آنتی‌بادی در بدن فرد آلوده از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. تشخیص ژنوم ویروس HCV در نمونه‌های مشکوک، از گسترش بیماری و شیوع روزافزون آن جلوگیری خواهد نمود. با استفاده از این روش که مبتنی بر شناسایی اسید نوکلئیک ویروس است، می‌توان عفونت را در مراحل ابتدایی و قبل از ظهور آنتی‌بادی‌های اختصاصی تشخیص داد. هدف از این پژوهش طراحی روش بسیار حساس و دقیق RT-Nested PCR‌ برای تشخیص عفونت HCV است. مواد و روش‌ها: روش RT-Nested PCR به‌منظور جداسازی توالی حفاظت شده از ناحیه ۵' UTR راه‌اندازی و به کار برده شد. ابتدا با استفاده از روش ترانس کریپتاز معکوس، سنتز cDNA از روی RNAژنوم ویروس صورت گرفت. پس از آن با روش Nested PCR با استفاده دو جفت آغازگر اختصاصی و طی دو مرحله، قطعه مورد نظر تکثیر شد. محـصولات PCR‌ به کـمک روش الـکتروفورز بررسی و همچنین از کیت تجاری RT-PCR یک مرحله‌ای برای مقایسه با نتایج حاصل از روش طراحی شده استفاده شد. نتایج: تعداد ۲۵ نمونه پلاسمای بیماران HCV مثبت که توسط روش‌های الایزا و وسترن بلات مثبت قطعی تشخیص داده شده بودند به‌عنوان نمونه‌های مثبت، رقت های مختلف از یک نمونه بیمار با تیتر بالا به‌عنوان استاندارد و ۲۵ نمونه پلاسمای منفی متعلق به اهداکنندگان خون سالم به‌عنوان کنترل منفی جمع‌آوری شده با این روش بررسی شد. در تمام موارد مثبت، باند مورد نظر روی ژل آگارز مشاهده شد. با توجه به این که در هیچ‌یک از نمونه‌های منفی باند مزبور ملاحظه نشد، مقایسه نتایج حاصل از روش طراحی شده با روش تجاری موجود همبستگی خوبی را نشان داد. نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج به دست آمده در این مطالعه، مشخص شد که روش راه‌اندازی شده در تشخیص عفونت HCV‌ از حساسیت و اختصاصیت بالایی برخوردار است. همچنین با توجه به حساسیت این روش، به‌نظر می‌رسد که می‌توان ژنوم ویروس را پیش از تغییرات سرمی و ظهور آنتی‌بادی‌ها تشخیص داد و از این رو می‌توان دوره پنجره را کوتاه‌تر نمود.

---

هدف: علیرغم غربالگری خون‌های اهدایی با روش‌های حساس مبتنی بر شناسایی آنتی‌بادی، همچنان خطر انتقال عفونت‌های ویروسی وجود دارد. بنابراین طراحی روش‌های حساس مبتنی بر شناسایی اسید نوکلئیک مورد توجه قرار گرفته است. هدف از این تحقیق طراحی روشی حساس‌تر در مرحله شناسایی نسبت به روش‌های معمول و همچنین تشخیص همزمان عفونت‌های ویروس نقص ایمنی اکتسابی تیپ یک و ویروس هپاتیت C در یک نمونه است. مواد و روش‌ها: پس از طراحی آغازگرها و پروب‌های اختصاصی دو ویروس و بهینه‌سازی روش واکنش زنجیره‌ای چندگانه، مرحله نشاندار کردن محصول با استفاده ازنوکلئوتیدهای متصل به دیگوگسی‌ژنین انجام شد. محصول به‌دست آمده ابتدا به دو قسمت مجزا تقسیم و پس از واسرشت شدن در شرایط قلیایی با پروب اختصاصی مجاور شد. پروب‌های حاوی بیوتین انتهایی پس از اضافه شدن به پلیت پوشش یافته با استرپت آویدین متصل شدند. پس از شستشو، آنتی‌بادی ضد دیگوگسی‌ژنین متصل به آنزیم آلکالن فسفاتاز به چاهک‌ها اضافه شد. در مرحله نهایی شستشو انجام و سوبسترا اضافه شد. با استفاده از روش رنگ‌سنجی نمونه‌های مثبت و منفی از نظر عفونت قابل شناسایی هستند. نتایج: ۳۵ نمونه با روش طراحی شده مورد آزمایش قرار گرفتند، که شامل ۲۷ نمونه مثبت و ۸ نمونه منفی تأیید شده و ۴ نمونه پانل استاندارد بودند. هیچ‌گونه نتیجه مثبت یا منفی کاذب مشاهده نشد. نتیجه‌گیری: روش طراحی شده دارای حساسیت و اختصاصیت قابل قبولی برای تشخیص عفونت ویروس نقص ایمنی اکتسابی تیپ یک و ویروس هپاتیت C در دوره پنجره می‌باشد به‌علاوه امکان کمی کردن روش وجود دارد، که در کنترل بیمار و پایش درمان مفید است. همچنین در کنار حساسیت بسیار بالا هزینه و زمان کمتری برای انجام آزمون نیاز است.

---

هدف: واکنش زنجیر پلیمراز یکی از مهم‏ترین پیشرفت‏ها در زمینه زیست‏شناسی و تشخیص مولکولی است. با وجود سادگی در مفهوم این روش نیازمند کنش‏های پیچیده بین توالی هدف، آغازگرها، dNTP و آنزیم پلیمراز به‏منظور تکثیر و تشخیص موفق است. شناسایی ویروس‏های RNA دار نیازمند استفاده از روش‏هایی با حساسیت و ویژگی بالا است، بنابراین تکثیر براساس روش Nested PCR تا حدی منجر به بهبود حساسیت شده و از سوی دیگر، یک مرحله‏ای کردن روش مذکور باعث کاهش آلودگی‏های احتمالی خواهد شد. هدف از مطالعه حاضر راه‏اندازی و به‏کارگیری روش جدید، سریع و حساس Nested PCR یک مرحله‏ای- یک لوله‏ای در سیستم بسته با استفاده از دو آغازگر به هم چسبیده است. مواد و روش‏ها: در این مطالعه، روش جدید و ویژه‏ای از طراحی آغازگر به‏منظور یک مرحله‏ای- یک لوله‏ای کردن واکنش استفاده شد. روش طراحی شده پس از راه‏اندازی و بهینه‏سازی، روی نمونه‏های کنترل مثبت و منفی ارزیابی شد. نتایج: روش راه‏اندازی شده، روی۵۰ نمونه مثبت ویروس هپاتیت C، ۱۰ کنترل منفی ژنوم انسانی و ۵ نمونه از هرکدام از ویروس‏های هپاتیت B، نقص ایمنی اکتسابی انسان، هپاتیت G و تورکوتنو انجام گردید. براساس نتایج به‏دست آمده از مجموع آزمایشات میزان حساسیت و ویژگی روش طراحی شده، محاسبه شد. در ۴۸ مورد از ۵۰ نمونه مثبت باند مورد انتظار مشاهده گردید و در هیچ‏یک از نمونه‏های کنترل منفی باندی مشاهده نشد. نتیجه‏گیری: براساس سیستم ویژه طراحی آغازگر که در مطالعه حاضر استفاده شد، آغازگرهای داخلی به‏صورت مکمل حالت معمول PCR و چسبیده به آغازگرهای خارجی ساخته می‏شوند. احتمال اتصال آغازگرهای خارجی و داخلی به الگوهای نادرست در هر دو دور واکنش غیرممکن می‏شود و در نتیجه باندهای غیراختصاصی تولید نخواهد شد. برتری دیگر روش طراحی شده عدم وجود آلودگی به دلیل یک مرحله‏ای شدن و علاوه بر آن؛ کوتاه‏تر شدن زمان واکنش و نیز کاهش هزینه‏ها است.

---

هدف: ویروس هپاتیت C یکی از عوامل شایع ایجاد عفونت مزمن در انسان است. کنترل تکثیر ویروس به سیستم ایمنی فرد وابسته است. مکانیسم‏های متعددی در ارتباط با اختلال در پاسخ مؤثر سیستم ایمنی بیان شده است که مکانیسم مرتبط با سلول‏های T تنظیمی یکی از فرضیه‏های جدید است. در این مطالعه برای اولین بار به بررسی نقش پروتئین نوکلئوکپسید ویروس هپاتیت C (HCV-core) در افزایش فرکانس سلول‏های T تنظیمی طبیعی در میان جمعیت پیچیده سلول‏های تک هسته‏ای خون محیطی پرداخته شد. مواد و روش‏ها: برای بررسی اثر نوکلئوکپسید ویروس هپاتیت C بر فرکانس سلول‏های T تنظیمی طبیعی اختصاصی ویروس هپاتیت C روی سلول‏های تک هسته‏ای خون محیطی ۱۹ بیمار که به شکل مزمن ویروس هپاتیت C آلوده بودند و نیز ۶ نفر به‏عنوان کنترل مطالعه شد. برای این منظور سلول‏های تک هسته‏ای خون محیطی از گروه‏های مختلف جدا و توسط آنتی‏ژن نوکلئوکپسید تحریک شد. سپس با روش فلوسایتومتری سه‏رنگی دستی، فرکانس سلول‏های T تنظیمی طبیعی ارزیابی شد. نتایج: نتایج بررسی حاضر نشان داد که به‏دنبال انکوباسیون سلول‏های تک هسته‏ای خون محیطی با آنتی‏ژن نوکلئوکپسید ویروس هپاتیت C، جمعیت سلول‏های T تنظیمی طبیعی در افراد آلوده به ویروس هپاتیت C نسبت به کنترل منفی افزایش داشته است. نتیجه‏گیری: نتایج این مطالعه از این نظریه که سلول‏های T تنظیمی طبیعی می‏تواند اختصاصاً به آنتی‏ژن ویروس هپاتیت C پاسخ دهد، حمایت می‏کند؛ بنابراین سلول‏های T تنظیمی طبیعی اختصاصی ویروس هپاتیت C می‏تواند یکی از دلایل پاسخ ضعیف سیستم ایمنی باشد که منجر به عفونت مزمن ویروس هپاتیت C و نیز تحمل ایمنی در هنگام عفونت ویروس هپاتیت C شود. پیشنهاد می‏شود در هنگام طراحی واکسن برای ویروس هپاتیت C از اپی‏توپ‏هایی که تکثیر شدید سلول‏های T تنظیمی طبیعی را موجب می‏شوند استفاده نشود.

---

هدف: هدف تولید یک سازه بیان کننده توالی یک ناحیه همپوشان از ژن NS۳ از ویروس ایزوله ایرانی است. مواد و روش‏ها: ابتدا بخش میانی ژن NS۳ با روش Nested-RT-PCR و با استفاده از سرم بیمار مبتلا به ژنوتیپ ۱a ویروس هپاتیت C تکثیر شد. بعد از کلون آن درون ناقل کلونینگ TA و غربالگری کلون‏ها براساس روش سفید- آبی و Colony-PCR این کلون‏های منتخب با روش تعیین توالی و هضم آنزیمی با BglII ارزیابی شد. توالی جدید با استفاده از نرم‏افزار با توالی‏های دیگر مرجع مقایسه و درخت تکاملی ترسیم شد. بخش میانی ژن NS۳ تأیید شده و سپس به درون سازه بیانی، کلون شد و کلون‏های مناسب با استفاده از دو نوع Colony-PCR شناسایی شد. ارزیابی نهایی بیان ژن با مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات روی سلول‏های ترانسفکت شده با سازه بیانی تأیید شد. نتایج: توالی میانی NS۳ از روی سرم بیمار تکثیر و نتایج توالی‏یابی و مقایسه ژنی نشان داد که این توالی به توالی‏های مرجع شباهت داشته و در شاخه ژنوتیپ ۱ ویروس هپاتیت C قرار دارد. با روش Colony-PCR وجود و نیز جهت ژن درون پلاسمید بیانی تأیید شد. مشاهده GFP توسط میکروسکوپ فلورسانس، روش RT-PCR و وسترن بلات به‏ترتیب نمایانگر انتقال موفق سازه، بیان ژن و نیز تولید پروتئین در سلول‏های ۲۹۳ بود. نتیجه‏گیری: سازه بیانی حاوی بخش میانی ژن NS۳ که بایستی فاقد فعالیت پروتئازی باشد، نسبت به طول کامل ژن NS۳ می‏تواند در القای بهتر ایمنی توسط سلول‏های عرضه کننده آنتی ژنی در موارد واکسن ویروس هپاتیت C مفیدتر واقع شود.

---

هدف: مطالعات حیوانی نشان می‏دهند که واکسیناسیون با پپتیدهای اپی‏توپی منجر به ایمنی حفاظتی می‏شود. با این وجود غلبه ایمنولوژیکی باید به‏عنوان یک چالش مهم در این زمینه مورد توجه قرارگیرد. با توجه به مزایای واکسن‏های اپی‏توپی علیه عفونت هپاتیت C، در این مطالعه بروز پدیده غلبه ایمنولوژیکی به‏دنبال ایمن‏سازی موش‏ها با سه ترکیب مختلف پپتیدهای اپی‏توپی ویروس هپاتیت C مقایسه شده است. مواد و روش‏ها: چهار پپتید اپی‏توپی وابسته به سلول‏های CD۸+ (C۱، E۶، N و E۴) برگرفته از آنتی‏ژن‏های ویروس هپاتیت C ساخته شد. پپتید چند اپی‏توپی (C۱E۶NE۴) حاصل از اتصال چهار اپی‏توپ نیز بر‏اساس مطالعات ایمونوانفورماتیک با هدف بهینه‏سازی برش پروتئازوم طراحی شد. موش‏های BALB/c سه تزریق زیرجلدی شامل ۱۰ میکروگرم پپتید (به‏صورت پپتید اپی‏توپی یا مخلوط اپی‏توپ‏ها یا پپتید پلی‏توپ) ترکیب شده با اجوانت‏های CpG (۵۰ میکروگرم) و MontanideISA۷۲۰ (۷۰ درصد) را در قاعده دم با فاصله سه هفته دریافت کردند. با توجه به وابستگی دو اپی‏توپ C۱ و E۴ به H۲-Dd موشی، سه هفته پس از آخرین تزریق از سلول‏های طحال موش‏های واکسینه در حضور پپتیدهای C۱ و E۴ برای آزمون‏های IFNg/IL۴ ELISpot استفاده شد. نتایج: در کلیه حیوانات واکسینه پاسخ Th۱ که با مشخصه ترشح بالای اینترفرون گاما و ترشح کم اینترلوکین ۴ شناخته می‏شود ایجاد شده بود. موش‏های ایمن شده با اپی‏توپ‏های تکی پاسخ قوی‏تری را نشان دادند، اما به‏علت گرایش بالاتر اپی‏توپ E۴ برای H۲-Dd پاسخ علیه آن قوی‏تر از پاسخ علیه اپی‏توپ C۱ بود که نمایانگر بروز درجاتی از غلبه ایمنولوژیکی است. نکته جالب توجه این‏که حیوانات واکسینه با پپتید پلی‏توپ اگر چه با شدت ضعیف‏تر اما پاسخ یکسانی را علیه هر دو اپی‏توپ C۱ و E۴ نشان دادند. نتیجه‏گیری: نتایج این مطالعه برتری پپتید پلی‏توپ را بر اپی‏توپ‏های تکی نشان داد و بر نقش کلیدی طراحی بهینه واکسن‏های پلی‏توپ برای جلوگیری از وقوع غلبه اپی‏توپی تأکید نمود.

---

سرین پروتئاز NS۳/۴A ویروس هپاتیت C یک هدف دارویی مهم برای درمان بیماران مبتلا به ویروس هپاتیت C می­باشد. با این حال، جهش اسید آمینه­ های آن، به ویژهA۱۵۶G ، معمولا منجر به ظهور سریع مقاومت دارویی می ­شود. داروهای بوسیپرویر، سیمپرویر و ونیپرویر از داروهای مورد تایید FDA، پروفایل­ های مقاومتی متمایز در برابر جهش A۱۵۶G پروتئاز NS۳/۴A ویروس هپاتیت C از خود نشان می­ دهند. به منظور نشان دادن رفتار هر یک از این داروها در میانکنش با پروتئاز NS۳/۴A در حالت وحشی و جهش یافته­ ی A۱۵۶G شبیه‌سازی دینامیک مولکولی و محاسبات انرژی آزاد اتصال بر روی هر یک از داروها در میانکنش با پروتئاز NS۳/۴A در هر دو حالت وحشی و جهش یافته انجام شد. محاسبات انرژی آزاد اتصال مبتنی بر مکانیک مولکولی مساحت سطح پواسون-بولتزمن نشان داد که تمایلات اتصال هر یک از داروها در میانکنش با پروتئاز NS۳/۴A در حالت وحشی تا حدود قابل توجهی بیشتر از میانکنش با پروتئاز در حالت جهش یافته­ی A۱۵۶G می­ باشد. محاسبات چشم اندازهای انرژی آزاد (FEL) مشخص کرد که که در حضور هر یک از داروها در میانکنش با پروتئاز وحشی و جهش یافته حوضه ­های انرژی بیشتری در مقایسه با پروتئاز در حالت آزاد تشکیل می­ شود. امیدواریم داده­ های ما بتواند بینش‌های مفیدی را برای طراحی یک داروی بازدارنده کارآمد جدید برای درمان بیماران مبتلا به ویروس هپاتیت C ارائه دهد.

---

هدف: امروزه ویروس هپاتیت C به‌عنوان یک مشکل سلامت در تمام دنیا مطرح است. عفونت ویروس هپاتیت C در اکثر موارد مزمن می‌شود و در ادامه به سمت فیبروز و سیروز و کارسینومای سلول‌های کبدی پیش می‌رود. بسیاری از تغییرات در سلول به واسطه پروتئین‌های ویروسی صورت می‌گیرد. هدف از این پژوهش، ارزیابی تأثیر پروتئین مرکزی ویروس هپاتیت C بر القای روند فیبرزایی در سلول است. مواد و روش‌ها: در این پژوهش از رده سلولی LX-۲ که از منشأ سلول‌های ستاره‌ای کبد است، استفاده شد. پلاسمید بیان کننده پروتئین مرکزی ویروس هپاتیت C به سلول‌ها ترانسفکت شد. پس از ۷۲ ساعت، استخراج RNA و پس از تیمار با DNase، cDNA تولید شد. سلول‌های کنترل مثبت نیز با هورمون فیبروتیک لپتین تیمار شدند. در آخر با استفاده از روشReal-Time PCR میزان بیان ژن اکتین آلفای عضله صاف اندازه‌گیری شد و مورد تجزیه و تحلیل آماری قرار گرفت. نتایج: یافته‌ها نشان دادند که پروتئین مرکزی ویروس هپاتیت C باعث افزایش بیان معنی‌دار در بیان ژن اکتین آلفای عضله صاف می‌شود (۰۵/۰ >P). بیان ژن اکتین آلفای عضله صاف در سلول‌های تیمارشده با لپتین بیشتر از سلول‌های تیمارشده با core ویروس هپاتیت C بوده است. نتیجه‌گیری: با توجه به یافته‌های به‌دست آمده، عفونت ویروس هپاتیت C عامل مؤثر در پیشبرد هپاتیت مزمن به سمت فیبروزه شدن بافت کبد است و در این میان، پروتئین Core ویروس هپاتیت C می‌تواند مسیر فیبرزایی در هپاتیت ویروسی را القا کند.  

---

ویروس هپاتیت C، یکی از علل اصلی سیروز و سرطان کبد در سراسر جهان است. قابل قبول‌ترین رژیم دارویی در درمان بیماران مبتلا به عفونت ویروس هپاتیت C استفاده از درمان ترکیبی پلی‏اتیلن گلیکول- اینترفرون به‌همراه ریباورین است. مطالعات متعددی نشان داده‌است که به‌دنبال استفاده از رژیم دارویی فوق به‌عنوان رژیم دارویی استاندارد، درصد نسبتاً کمی از مبتلایان به ژنوتیپ‌های ۱ و ۴ ویروس به حالت پاسخ‌های ویروسی پایدار (SVR) (حذف دائم ویروس) می‌رسند (۴۲-۴۶ درصد) این در حالیست که میزان پاسخ‌های ویروسی پایدار در مورد ژنوتیپ‌های ۲ و ۳ ویروس به مراتب بهتر است (۷۶-۸۲ درصد). در مجموع، زمان مناسب برای رسیدن به پاسخ‌های ویروسی پایدار در مورد ژنوتیپ‌های ۱ و ۴ یک سال است در حالی که طول این مدت در ژنوتیپ‌های ۲ و ۳ حدود ۶ ماه است. از سال ۲۰۱۱ استفاده از داروهای ضد ویروسی با عملکرد مستقیم علیه ویروس هپاتیت C برای درمان بالینی آغاز شد که به‌طور مستقیم پروتین‌های کد شده توسط ویروس را مورد هدف قرار می‌دهند. نسل اول مهارکننده‌های "پروتئازHCV NS۳/۴A " مانند تلاپریویر (Telaprevir) سبب افزایش پاسخ ویروسی پایدار در بیماران مبتلا به ویروس هپاتیت C شد. با وجود پتانسیل بالقوه این داروها، رژیم درمانی مذکور با عوارض جانبی شدید همراه است. برای بیماران مبتلا به ویروس هپاتیت C که به درمان سخت جواب می‌دهند، گزینه‌های درمانی بیشتری مورد نیاز است. مطالعات بیشتر برای اثر بخشی و کاهش آثارجانبی داروها نگاه‌ها را به سمت دنیای مولکولی و میکروRNAها سوق داد. میکروRNAها، نقش مهمی در استقرار عفونت ویروس هپاتیت C که در تکثیر ویروس مؤثر است. در مطالعه مروری حاضر تلاش شده است که از یک طرف عفونت ویروس هپاتیت C، میکروRNAها، بیوژنز آن‌ها و سایر موارد بررسی شود و از طرف دیگر نقش میکروRNAها در چرخه تکثیر HCV ونیز ژنوتیپ‌های مختلف ویروس مورد بحث قرار می‌گیرد.