جستجو در مقالات منتشر شده
۵ نتیجه برای پیکیا پاستوریس
ساره ارجمند، لیلا قبادی، سیدامید رعنایی‌سیادت، یحیی سفیدبخت، فاطمه فرزانه،
دوره ۹، شماره ۳ - ( ۶-۱۳۹۷ )
چکیده
اهداف: اینورتاز آنزیمی است که به‌صورت گسترده در صنایع مورد استفاده قرار می‌گیرد. منبع اصلی تولید صنعتی آنزیم اینورتاز مخمر ساکارومایسس سرویزیه است. افزایش پایداری حرارتی در این آنزیم کمک مهمی به افزایش بهره‌وری در تولید مربوطه خواهد کرد. هدف پژوهش حاضر افزایش پایداری حرارتی پروتئین نوترکیب اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با ایجاد جهش‌های هدفمند بود.
مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربی حاضر، با الگوقراردادن آنزیم اینورتاز باکتری گرمادوست ترماتوگا ماریتیما به‌منظور افزایش پایداری حرارتی، اسیدآمینه‌های ترئونین ۳۴۵ و آسپارژین ۳۴۹ در ژن پروتئین اینورتاز ساکارومایسس سرویزیه با روش جهش‌زایی هدفمند با آلانین جایگزین و در مخمر پیکیا پاستوریس همسانه‌سازی با واکنش زنجیره‌ای پلیمراز SOEing انجام شد. فعالیت آنزیم‌های نوترکیب اینورتاز طبیعی و جهش‌یافته در دماهای مختلف، pHهای مختلف، مدت‌زمان پایداری و پایداری حرارتی- عملکردی اندازه‌گیری و نمودار میکائیلیس- منتن رسم شد.
یافته‌ها: پایداری حرارتی- ساختاری آنزیم‌های طبیعی و جهش‌یافته اینورتاز در دمای ۵۵ºC نشان داد که آنزیم جهش‌یافته در دمای ۵۵ºC نسبت به آنزیم طبیعی پایدرای حرارتی بالاتری داشت. هر دو آنزیم طبیعی و جهش‌یافته در پایداری عملکردی روند مشابهی را نشان دادند. کاهش Km و افزایش Vmax در سوبسترای ساکاروز و افزایش ۵برابری نسبت Kcat/Km در آنزیم جهش‌یافته دیده شد.
نتیجه‌گیری: جهش‌های هدفمند اعمال‌شده هیچ اثر منفی روی میزان تولید و همچنین ترشح پروتئین نوترکیب اینورتاز ندارد و باعث افزایش فعالیت آنزیم میشود. آنزیم جهش‌یافته نسبت به آنزیم طبیعی، پایداری ساختاری بالاتری دارد، بدون این که تغییری در پایداری عملکردی آن ایجاد کند.
زهرا فتحی، مسعود مشهدی اکبر بوجار، احسان دهنوی، رضا حسن ساجدی،
دوره ۱۱، شماره ۱ - ( ۱۲-۱۳۹۸ )
چکیده
آنژیوژنز[۱] غیرطبیعی با بیماریهای مختلف نظیر سرطان و متاستاز آن، رتینوپاتی و آرتریت روماتوئید در ارتباط است. VEGF-A
[۲] مهمترین واسطهی آنژیوژنز در میان تمام فاکتورهای رشد است. فعالیت زیستی VEGF
توسط دو گیرنده تیروزین کینازی VEGFR-۱
و VEGFR-۲
سلولهای اندوتلیال وساطت میشود. سیگنالینگ VEGF
از طریق VEGFR-۲
مسیر اصلی آنژیوژنز است که منجر به تحریک رشد سریع سلولهای اندوتلیال به داخل تومور میشود. این رسپتور از یک بخش خارج سلولی، یک بخش سیتوپلاسمی و یک دُمین ترانس ممبران تشکیل شده است. بخش خارج سلولی متشکل از هفت دُمین شبه ایمونوگلوبولین (D۱-D۷
) است که دُمین های اول تا سوم به عنوان جایگاه اتصال لیگاند عمل میکنند. در این مطالعه دُمین های خارج سلولی ۳-۱ گیرنده (KDR۱-۳
) بصورت نوترکیب در Pichia pastoris بیان شد. یک قطعه DNA
۹۷۵ نوکلوتیدی حاوی دُمین های ۳-۱ براساس توالی نوکلئوتیدی در GenBank
و توالی پروتئین در Swiss-Prot
طراحی شد. وکتور بیانی ترشحی نوترکیب (pPinkαHC/KDR۱-۳
) ساخته شد و به روش الکتروپوریشن به داخل مخمر منتقل شد. سلول های نوترکیب با بیان بالا از طریق تکمیل اگزوتروفی آدنین شناسایی و کشت شدند. KDR۱-۳
تحت القا با متانول ۱٪ بیان و با SDS-PAGE
و تکنیک وسترن بلات تایید شد. پس از تخلیص با کروماتوگرافی تمایلی با رزین Ni-NTA
، اتصال محصول بیان شده به hVEGF۱۶۵
با الایزای مستقیم و الایزای مبتنی بر گیرنده اثبات شد. نتایج نشان داد که دُمین خارج سلولی ۳-۱ گیرنده VEGFR-۲
انسانی با ساختار پروتئین یوکاریوتی، که هیچ گزارشی در مورد آن وجود ندارد، با موفقیت بیان شد.
[۲] Vascular endothelial growth factor-A
دوره ۱۲، شماره ۴ - ( ۱۲-۱۳۸۸ )
چکیده
هدف: آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحی (SAP۲) کاندیدا آلبیکنس نقش محوری در اتصال، تهاجم و بیماریزایی این مخمر فرصتطلب دارد. هدف از این مطالعه کلون نمودن، بیان و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم SAP۲ است. همچنین در این تحقیق برای اولین بار، از سیستم یوکاریوتی پیکیا پاستوریس برای بیان پروتئین نوترکیب SAP۲ استفاده شد.
مواد و روش‌ها: ژن Sap۲ کاندیدا آلبیکنس با انتهاهای چسبان EcoR۱ و SacII توسط PCR تکثیر و درون ناقل T/A سابکلون شد. با استفاده از آغازگرهای عمومی توالی این ژن تعیین شد و سپس درون ناقل بیانی pGAPZαA قرار گرفت. سازه نوترکیب به درون مخمر پیکیا پاستوریس انتقال داده شد. ژن Sap۲ طی پدیده نوترکیبی همولوگ درون ژنوم مخمری پیکیا پاستوریس داخل شد. پروتئین بیان شده به کمک روش وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتیبادی مونوکلونال بر علیه پروتئین SAP۲ تأیید شد. در نهایت پروتئین بهدست آمده با کمک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA تخلیص و فعال بودن آنزیم تأیید شد.
نتایج: در این تحقیق تکثیر ژن Sap۲ کاندیدا آلبیکنس و وارد نمودن آن درون ژنوم مخمر بیانی پیکیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ انجام شد. علاوه بر این، کلونی از مخمر را بهدست آمد که پروتئین نوترکیب SAP۲ را به محیط ترشح میکرد. بالاترین بیان پس از طی زمان ۹۶ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتیگراد بهدست آمد.
نتیجه‌گیری: القای ژن Sap۲ در مخمر پیکیا پاستوریس منجر به افزایش قدرت بیان انبوه این ژن نسبت به سیستم بیانی باکتریایی میشود. همچنین نیاز به تغییرات بعد از ترجمه و فعال نمودن آنزیم، به علت استفاده از سیستم بیانی یوکاریوتی، از بین میرود. برطبق یافتههای تحقیق حاضر، آسپارتیل اسید پروتئیناز تخلیص شده در این تحقیق خود فعال بوده و قادر به تجزیه BSA بهعنوان یک سوبسترا است. این پروتئین نوترکیب در pH اسیدی بیشترین فعالیت را دارد.
دوره ۱۵، شماره ۱ - ( ۱-۱۳۹۱ )
چکیده
هدف: آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز آنزیم هومودیمری است که قادر به هیدرولیز پیوندهای فسفواستر و کاهش سمیت نوروتوکسین‌های ارگانوفسفره است. این خصوصیت آنزیم، ارگانوفسفر هیدرولاز را ابزار ارزشمندی برای تجزیه، تشخیص و زیستپالایی سموم ارگانوفسفره می سازد.
مواد و روش ها: در این مطالعه ژن آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز باکتری سودوموناس دیمینوتا پس از بهینهسازی برای مخمر پیکیا پاستوریس و تبدیل آن به فرم ترشحی (آنزیم ارگانوفسفر هیدرولاز به فرم غشایی در باکتری وجود دارد) در ناقل بیانی pPICZαB کلون شد. پس از ترانسفورم و القای مخمرهای نوترکیب، آنزیم به لحاظ تجزیه سموم، تعیین پارامترهای بیوشیمیایی و سینتیکی ارزیابی شد.
نتایج: آنزیم به میزان ۴۹/۷ مرتبه و با فعالیت ویژه ۱۰۳ × ۴۲۱/۰ واحد در میلیگرم پروتئین و با بازده ۳۳ درصد از محلول رویی محیط کشت، جداسازی و خالص سازی شد. آنزیم بهترین فعالیت و پایداری را تا دمای ۵۰ درجه سانتیگراد و pH ۷ تا ۱۰ از خود نشان داد. با استفاده از سوبسترای پارااکسون، ثابت میکائیلیس (Km) و حداکثر سرعت آنزیم (Vmax) بهترتیب ۹۶/۴۵ میکرومولار و ۲۳/۱۱ میکرومولار در دقیقه محاسبه شد. آنزیم نسبت به کاتیونهای دو ظرفیتی بسیار حساس بود و توسط عوامل واسرشته کننده نظیر سدیم دودسیل سولفات فعالیت خود را از دست داد. وزن مولکولی آنزیم با استفاده از الکتروفورز SDS-PAGE حدود ۴۰ کیلودالتون تخمین زده شد.
نتیجه‌گیری: بر اساس نتایج بررسی حاضر آنزیم بهطور مؤثری سموم ارگانوفسفره نظیر پارااکسون را تجزیه می کند. فعالیت و پایداری در pH و دماهای بالا و همچنین پایین بودن ثابت میکائیلیس آنزیم نسبت به انواع باکتریایی، آن را کاتالیزگر زیستی مناسبی برای کاربردهای زیستپالایی و تشخیصی می سازد.
دوره ۱۵، شماره ۸۳ - ( ۱۰-۱۳۹۷ )
چکیده
اسیدآلفالینولنیک یکی از اجزای تشکیل دهنده اسیدهای چرب امگا۳ می باشد که برای حفظ سلامت بدن انسان ضروری بوده ولی در داخل بدن انسان ساخته نمی شوند. هدف از این پژوهش همسانه سازی ژن دلتا۱۵دسچوراز به منظور افزایش تولید اسیدآلفالینولنیک در گیاهان دانه روغنی می باشد. بدین منظور، پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از مخمر پیکیا پاستوریس سویه GS۱۱۵، این ژن توسط پرایمرهای اختصاصی حاوی توالی کوزاک تکثیر، و جهت توالی یابی در وکتورPTZ۵۷R/T همسانه سازی شد. قطعه نوترکیب پس از تایید توالی از وکتور TA جدا و به pBluescript KS(+) حاوی پروموتر ناپین الحاق شد. سپس سازه ژنی طراحی شده جهت انتقال به گیاه، در ناقل دوگانه pBI۱۲۱ همسانه سازی و به آگروباکتریوم تومیفاسینس سویه LBA۴۴۰۴، منتقل شد. خصوصیات بیوانفورماتیکی ژن مورد بررسی توسط ابزارهایی مانندTopPred TMHMM,، ProtParam وSOPMA بررسی گردید. نتایج واکنش PCR و تکثیر قطعه ای به طول bp۱۲۴۶ صحت همسانه سازی این ژن را تایید کرد. همچنین تکثیر قطعه ای به طول bp ۱۲۱۰ توسط پرایمرهای داخلی پروموتر ناپین و ژن دلتا ۱۵دسچوراز، و نیز ایجاد قطعه bp ۲۱۴۵ در هضم آنزیمی، تاییدی بر الحاق صحیح این ژن در امتداد پروموتر ناپین بود. نتایج توالی یابی نوکلئوتیدی نشان داد که توالی کد کننده این آنزیم مشتمل بر ۱۲۴۶ نوکلئوتید و کد کننده ۴۱۵ اسید آمینه می باشد. آنالیز توالی آمینواسیدی وجود دو دومین و ۵ هلیکس تراغشایی را تایید کرد. همچنین پیش بینی خواص پروتئینی، بررسی سیگنال پپتیدها و ساختار دوم، ثابت کرد که این آنزیم جزء آنزیم های پایدار و غشایی می باشد.
