---

خلاصه مقدمه: ویروس سرخک عضو خانواده پارامیکسو ویروسها و از جنس موربیلی ویروسها است که دارای ژنوم RNA با قطبیت منفی است. روش: در این طرح ابتدا اقدام به استخراج RNA از محیط حاوی ویروسهای سرخک سوش واکسینال AIK-C که روی سلولهای MRC-۵ رشد کرده بودند٬ گردید.RNA استخراج شده فورا " جهت ساخت cDNA تک رشته ای با استفاده از واکنش نسخه برداری معکوس مورد استفاده قرار گرفت. cDNA تک رشته ای بعنوان رشته الگو جهت تکثیر ژن F بوسیله پرایمرهای اختصاصی در واکنش PCRاستفاده شد. محصول PCR با طول مورد نظرbp ۱۶۶۲ درون وکتورهای بیانی pET-۲۸a(+) و pET-۲۲b(+) کلون گردید. جهت تایید کلونینگ٬ پلاسمیدهای نوترکیب بدرون سلولهای مستعد E.coli DH۵α ترانسفورم شدند وکلونیهای بدست آمده با استفاده از PCR مستقیم غربالگری شدند. سپس پلاسمیدهای نوترکیب بروش لیز قلیایی استخراج شدند یافته ها: هضم آنزیمی پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از آنزیمهای محدود الاثر Nde I وHindIII انجام گرفت که قطعه DNA بطول bp ۱۶۶۲ جداسازی شد. پلاسمید نوترکیب pET-۲۸aF توسط شرکت MWG آلمان تعیین توالی شد. مقایسه این توالی با توالی ژن F ویروس سرخک از بانک ژن (سوش واکسینال ادمونستون (AIK-C) با Accession number : AF۲۶۶۲۸۶) انجام گرفت و همولوژی بالایی برای این ژن مشاهده گردید. نتیجه گیری: نتایج این تحقیق نشان داد ژن F بسیار حفاظت شده و پایدار است. این پایداری باعث اهمیت بررسی این ژن در تهیه واکسن نوترکیب شده است.

---

گروهی از باکتری‌های همزیست با گیاهان، تحت عنوان PGPR (باکتری های محرک رشد گیاهان) آنزیمی به نام ACC دآمیناز (EC۴,۱.۹۹.۴) را کد می‌کنند که این آنزیم، تنظیم کننده‌ی تولید اتیلن از طریق متابولیزه نمودن ACC (حد واسط بیوسنتز اتیلن) و شکستن آن به آمونیاک و α-کتوبوتیرات می‌باشد. این آنزیم نقش مهمی در تسهیل رشد گیاهان از طریق کاهش میزان اتیلن بخصوص در شرایط سخت محیطی دارد. بنابراین هدف این مطالعه، بیان، تخلیص و تعیین شرایط بهینه‌ی فعالیت آنزیم ACC-دآمیناز (ACCD) از سویه FY۳۲ باکتری سودوموناس فلورسنس و بررسی خصوصیات سینتیکی این آنزیم می‌باشد. بدین منظور، ژن acdS از باکتری سودوموناس فلورسنس بومی جداسازی و در وکتور بیانی pET۲۸ a(+) کلون شد و سپس وکتور نوترکیب pET۲۸-acdS به باکتری E. coli سویه‌ی BL۲۱(DE۳) منتقل گردید. پس از مشاهده بیان، آنزیم ACCD توسط ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل-سفاروز تخلیص و سپس، شرایط بهینه‌ی فعالیت این آنزیم و خصوصیات سینتیکی آن مورد بررسی قرار گرفت. مشخص گردید که این آنزیم، در ۷ pH: و دمای ۲۸ درجه سانتی‌گراد بیشترین فعالیت را دارد. این آنزیم فعالیت بالایی را در حضور MgSO۴ در مقایسه با سایر یون‌های فلزی مورد مطالعه نشان داد. همچنین کاهش فعالیت آنزیم در غلظت ppm ۱۶۰ نمک NaCl معنی‌دار بود. با توجه به پارامترهای سینتیکی آنزیم یعنی Km (mM ۶۶/۹) و Vmax (nM α-ketobutyrate mg-۱ h-۱ ۱۱/۰)، مشخص گردید که کارایی این آنزیم در مقایسه با ACCDهای شناخته شده قبلی نسبتا بالاست.

---

---

---

---

---

پیسیدین در از بین بردن میکروارگانیسم ها اعم از باکتری، قارچ، ویروس، انگل طیف گسترده ای دارد و دارای فعالیت قوی ضدتوموری است و در افزایش ایمنی ذاتی نقش دارد و لذا در برابر باکتری ها مقاومت ایجاد نمی کند؛ بنابراین از اهمیت بالایی در آبزی پروری برخوردار است. در این پژوهش کلونینگ ژن پیسیدین ماهی شانک سر طلایی (Sparusaurata) در وکتور pTZ۵۷R/T صورت گرفت. محصول اتصال به سلول های مستعد باکتری E. coli سویه DH۵α منتقل شدند. از تک کلنی های مشاهده شده در پلیت آمپی سیلین، استخراج پلاسمید انجام گرفت. تا^ءیید صحت تک کلنی های رشد یافته در این پژوهش، با روش های PCR مستقیم و تعیین توالی انجام گردید. قطعه تکثیر شده cDNA ژن پیسیدین ماهی شانک سرطلایی متشکل از ۳۱۰ نوکلئوتید و ۵۷ آمینواسید است. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد که ژن پیسیدین در وکتور pTZ۵۷R/T با موفقیت کلون گردیده است. مقایسه توالی نوکلئوتیدی ژن پیسیدین در این پژوهش شباهت بالایی را با پیسیدین ۵ گونه Morone chrysops نشان داد. مقایسه توالی آمینواسیدی سیگنال پپتید پیسیدین کاملا مشابه با Dicentracin-like همین گونه ثبت شده در بانک ژنی بوده و توالی پپتید بالغ پیسیدین تنها در سه آمینواسید با Pleorocidin-like گونه Poesila farmosa و Dicentracin-like گونه Sphaeramia orbicularis شباهت دارد. این پژوهش می تواند گامی برای مطالعات بعدی پپتید پیسیدین باشد.

---

هدف: لیشمانیوزیس جزء بیماری‌های عفونی– انگلی مهم دنیاست که توسط تک یاخته‌های نسجی خونی داخل سلولی اجباری از جنس لیشمانیا ایجاد می‌شود. ژن LACK یک پروتئین ۳۶ کیلودالتونی است که در فرم‌های پروماستیگوت و آماستیگوت انگل، در گونه‌های مختلف لیشمانیا به مقدار بالایی وجود دارد. LACK پاسخ ایمنی سریعی علیه انگل ایجاد می‌کند؛ بنابراین این ژن برای تهیه آنتی‌ژن نوترکیب مناسب بوده و انتخاب خوبی به‌عنوان واکسن DNA علیه لیشمانیا ماژور است، این مطالعه با هدف کلون نمودن ژن LACK لیشمانیا ماژور ایران برای تولید پروتئین نوترکیب برای ساخت واکسن انجام شده است. مواد و روش‌ها: در این تحقیق DNA از سویه استاندارد ایرانی لیشمانیا ماژور (MRHO/IR/۷۵/ER) استخراج و ژن LACK با استفاده از روش PCR تکثیر شد. سپس قطعه ۹۳۹ جفت‌بازی تکثیر شده در پلاسمید pTZ۵۷R/T کلون شد. پلاسمید نوترکیب در باکتری اشرشیاکلی سویه TG۱ ترانسفورم و توالی‌یابی شد. نتایج: آنالیز تعیین توالی ژن LACK لیشمانیا ماژور کلون شده در پلاسمید pTZ۵۷R/T مشخص کرد که قطعه‌ای ۹۳۹ جفت‌بازی در این پلاسمید کلون شده است و ژن کلون شده، ژن LACK لیشمانیا ماژور است. این سویه ایرانی ۸۹ درصد با سویه موجود در بانک ژنی با کد LmjF۲۸,۲۷۴۰ شباهت دارد. این کلونینگ با روش‌های PCR و برش آنزیمی تأیید شد. نتیجه‌گیری: نتایج به‌دست آمده نشان داد که این ژن با موفقیت تکثیر و کلون شده و از این کلون می‌توان کلون‌هایی در پلاسمید بیانی پروکاریوتی برای تهیه آنتی‌ژن نوترکیب و پلاسمید یوکاریوتی برای تهیه واکسن DNA استفاده کرد. این مطالعه راهی برای پیشرفت تولید پلاسمیدهای نوترکیب برای مطالعات آینده است.

---

هدف: توکسوپلاسما گونده ای تک یاخته ای داخل سلولی و عامل ایجاد توکسوپلاسموزیس بوده و دارای انتشار جهانی است. در سال های اخیر پیشرفت هایی در زمینه تهیه واکسن صورت گرفته که منجر به ایجاد پاسخ های محافظت کننده شده است. آنتی ژن GRA۷ با وزن مولکولی ۲۹ کیلودالتون یک آنتی ژن ترشحی گرانولی فشرده است که به وسیله سلول های آلوده میزبان آزاد می شود. در سلول های آلوده به تاکی زوئیت، پروتئین ۲۹ کیلو دالتونی در واکوئل پارازیتوفروز تجمع پیدا می کند. علاوه بر ایمونوژن بودن و کاندیدای تهیه واکسن در تشخیص نیز به کار می رود. مواد و روش ها: برای این کار ابتدا DNA توکسوپلاسما گونده ای با روش فنل کلروفرم استخراج شده سپس با استفاده از آغازگرهای اختصاصی ژن GRA۷ این قطعه با استفاده PCR تکثیر و در ناقل TOPO کلون شد. پلاسمید کلون شده در باکتری TOP۱۰ ترانسفورم شد. با استفاده از PCR، هضم آنزیمی و توالی یابی کلون مورد نظر تأیید شد. نتایج: تعیین توالی ژن GRA۷ کلون شده در پلاسمید TOPO نشان داد که قطعه ای ۷۴۹ جفت بازی در این پلاسمید کلون شده است و با سویه RH موجود در بانک ژنی ازنظر توالی نوکلئوتیدی فقط در یک باز تفاوت داشت. نتیجه گیری: نتایج به دست آمده نشان می دهد که کلون به دست آمده برای ساب کلون کردن در پلاسمیدهای بیانی یوکاریوتی و پروکاریوتی مناسب است.

---

مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئین­ها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف می­کنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلول­های سرطانی مشاهده می­شود اما در بافت­های نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است به­عنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-۲۸a  و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود.
ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin  تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-۲۸a با آنزیم­های محدودگر  HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH۵a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونی­ها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL۲۱)  ترنسفورم شد. بیان survivin  در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.
 اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-۲۸a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالی­یابی تشابه ۱۰۰% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای ۳۷ درجه سانتیگراد از زمان ۲ ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.
 

---

هدف: آنزیم آسپارتیل پروتئیناز ترشحی (SAP۲) کاندیدا آلبیکنس نقش محوری در اتصال، تهاجم و بیماری‏زایی این مخمر فرصت‏طلب دارد. هدف از این مطالعه کلون نمودن، بیان و بررسی خصوصیات بیوشیمیایی آنزیم SAP۲ است. همچنین در این تحقیق برای اولین بار، از سیستم یوکاریوتی پیکیا پاستوریس برای بیان پروتئین نوترکیب SAP۲ استفاده شد. مواد و روش‏ها: ژن Sap۲ کاندیدا آلبیکنس با انتهاهای چسبان EcoR۱ و SacII توسط PCR تکثیر و درون ناقل T/A ساب‏کلون شد. با استفاده از آغازگرهای عمومی توالی این ژن تعیین شد و سپس درون ناقل بیانی pGAPZαA قرار گرفت. سازه نوترکیب به درون مخمر پیکیا پاستوریس انتقال داده شد. ژن Sap۲ طی پدیده نوترکیبی همولوگ درون ژنوم مخمری پیکیا پاستوریس داخل شد. پروتئین بیان شده به کمک روش وسترن بلاتینگ و با استفاده از آنتی‏بادی مونوکلونال بر علیه پروتئین SAP۲ تأیید شد. در نهایت پروتئین به‏دست آمده با کمک ستون کروماتوگرافی میل ترکیبی Ni-NTA تخلیص و فعال بودن آنزیم تأیید شد. نتایج: در این تحقیق تکثیر ژن Sap۲ کاندیدا آلبیکنس و وارد نمودن آن درون ژنوم مخمر بیانی پیکیا پاستوریس با روش نوترکیبی همولوگ انجام شد. علاوه بر این، کلونی از مخمر را به‏دست آمد که پروتئین نوترکیب SAP۲ را به محیط ترشح می‏کرد. بالاترین بیان پس از طی زمان ۹۶ ساعت در دمای ۳۰ درجه سانتی‏گراد به‏دست آمد. نتیجه‏گیری: القای ژن Sap۲ در مخمر پیکیا پاستوریس منجر به افزایش قدرت بیان انبوه این ژن نسبت به سیستم بیانی باکتریایی می‏شود. همچنین نیاز به تغییرات بعد از ترجمه و فعال نمودن آنزیم، به علت استفاده از سیستم بیانی یوکاریوتی، از بین می‏رود. برطبق یافته‏های تحقیق حاضر، آسپارتیل اسید پروتئیناز تخلیص شده در این تحقیق خود فعال بوده و قادر به تجزیه BSA به‏عنوان یک سوبسترا است. این پروتئین نوترکیب در pH اسیدی بیشترین فعالیت را دارد.

---

اهداف: مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایند مهمی است که طی تکامل بدون تغییر باقی مانده است. این فرایند در تنظیم شرایط فیزیولوژیکی و پاتوفیزیولوژیکی موثر است. آپوپتوز شناخته شده_­ترین نوع مرگ سلولی است که در بسیاری از تومورها مختل شده و سبب مقاومت به درمان می شود. کاسپاز۹ یکی از پروتئین­های کلیدی مسیر میتوکندریایی آپوپتوز است. فعال شدن کاسپاز۹ منجر به فعال شدن کاسپاز­های اجرایی مانند کاسپاز۳/۷ شده و با راه اندازی آبشار کاسپازی منجر به مرگ سلول می­­شود. در این مطالعه، ژن کاسپاز۹ در وکتور یوکاریوتی pcDNA۳,۱(+) کلون و عملکرد آن در سلول­ بررسی شد.
مواد و روش­ها: ژن کاسپاز۹ طی PCR با پرایمر­های اختصاصی تکثیر و پس از هضم دوگانه با آنزیم­های KpnI و BamHI به پلاسمید pcDNA برش خورده الحاق شد. پلاسمید نوترکیب حاصل پس از تعیین توالی به رده سلولی SH-SY۵Y ترنسفکت و با داروی دوکسوروبیسین تیمار شد. عملکرد آن بر مرگ سلولی با روش رنگ آمیزی تریپان بلو و PI، و سنجش فعالیت کاسپاز۳ بررسی و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد.
یافته ها: کلونینگ ژن کاسپاز۹ انجام و بیان آن در سلول با وسترن بلات تایید شد. افزایش بیان کاسپاز۹ در سلول منجر به پردازش خود بخودی آن طی همودایمریزاسیون و در نتیجه القای مرگ سلولی شده و حساسیت سلول نسبت به دوکسوروبیسین را افزایش و زنده مانی سلولی را کاهش داد.
نتیجه گیری: ژن کاسپاز۹ کلون شده در سلول فعالیت نشان داد و آپوپتوز را در حضور دوکسوروبیسین از طریق خود فعال­سازی و متعاقبا تشدید فعال­سازی کاسپاز۳ افزایش داد.
 

---

چکیده
فرآیند ترمیم زخم، یک فرآیند پیچیده و پویا است که انواع سلول­ها و مسیرهای متابولیکی را مختلف را درگیر می­کند. این فرآیند از سه فاز التهابی، تکثیر سلولی و بازسازی بافتی تشکیل شده است. بهبود موفقیت آمیز زخم به تنظیم دقیق و هماهنگی بین عوامل درگیر بستگی دارد. تا سال­های اخیر استراتژی درمان­های زخم­های مزمن به آماده­سازی زخم، برداشتن بافت نکروزه شده، کنترل عفونت و التهاب محدود می­شد اما اخیرا استفاده از فاکتورهای رشد در جهت تسریع روند درمانی و بهبود زخم تایید شده­اند. از اولین انواع فاکتورهای رشد نوترکیب که در درمان زخم­های دیابتی به تایید رسیده است، فاکتور رشد نوترکیب انسانی PDGF-BB می‌باشد. مطالعات مختلف گزارش کرده است که PDGF به عنوان یک واسطه ی مهم در بهبود زخم در تسریع بهبودی، بهبود التهاب، تکثیر سلولی، رگزایی و بازسازی بافت کمک می­کند. در این مطالعه، توالی ژن PDGF-B انسانی، جهت کلون کردن در وکتور بیانی pET ۲۱(a+) قرار گرفت و سپس برای بیان آن در میزبان E.coli shuffle تحت پروموتور T۷ وارد شد. خالص­سازی پس از بیان با استفاده از ستون نیکل آگارز انجام شد و جهت بررسی فعالیت پروتئین تخلیص شده، آزمایش­های تکثیر سلولی، مهاجرت و اتصال به پروتئین ماتریکس خارج سلولی بررسی شد. نتایج حاصل از این مطالعه نشان داد که نوع دیمر PDGF بیان و تخلیص شده در میزبان باکتریایی احتمالا بدلیل حفظ ساختار فولد شده صحیح، دارای هر دو فعالیت اصلی یعنی تکثیر سلولی بدلیل اتصال فعال به گیرنده سلولی و همچنین قابلیت اتصال به فیبرینوژن را حفظ کرده است.
 

---

اسیدآلفالینولنیک یکی از اجزای تشکیل دهنده اسیدهای چرب امگا۳ می باشد که برای حفظ سلامت بدن انسان ضروری بوده ولی در داخل بدن انسان ساخته نمی شوند. هدف از این پژوهش همسانه سازی ژن دلتا۱۵دسچوراز به منظور افزایش تولید اسیدآلفالینولنیک در گیاهان دانه روغنی می باشد. بدین منظور، پس از استخراج RNA و سنتز cDNA از مخمر پیکیا پاستوریس سویه GS۱۱۵، این ژن توسط پرایمرهای اختصاصی حاوی توالی کوزاک تکثیر، و جهت توالی یابی در وکتورPTZ۵۷R/T همسانه سازی شد. قطعه نوترکیب پس از تایید توالی از وکتور TA جدا و به pBluescript KS(+) حاوی پروموتر ناپین الحاق شد. سپس سازه ژنی طراحی شده جهت انتقال به گیاه، در ناقل دوگانه pBI۱۲۱ همسانه سازی و به آگروباکتریوم تومیفاسینس سویه LBA۴۴۰۴، منتقل شد. خصوصیات بیوانفورماتیکی ژن مورد بررسی توسط ابزارهایی مانندTopPred TMHMM,، ProtParam وSOPMA بررسی گردید. نتایج واکنش PCR و تکثیر قطعه ای به طول bp۱۲۴۶ صحت همسانه سازی این ژن را تایید کرد. همچنین تکثیر قطعه ای به طول bp ۱۲۱۰ توسط پرایمرهای داخلی پروموتر ناپین و ژن دلتا ۱۵دسچوراز، و نیز ایجاد قطعه bp ۲۱۴۵ در هضم آنزیمی، تاییدی بر الحاق صحیح این ژن در امتداد پروموتر ناپین بود. نتایج توالی یابی نوکلئوتیدی نشان داد که توالی کد کننده این آنزیم مشتمل بر ۱۲۴۶ نوکلئوتید و کد کننده ۴۱۵ اسید آمینه می باشد. آنالیز توالی آمینواسیدی وجود دو دومین و ۵ هلیکس تراغشایی را تایید کرد. همچنین پیش بینی خواص پروتئینی، بررسی سیگنال پپتیدها و ساختار دوم، ثابت کرد که این آنزیم جزء آنزیم های پایدار و غشایی می باشد.