جستجو در:
دوره 11، شماره 3 - ( 1399 )
جلد 11 شماره 3 صفحات 14-8 |
برگشت به فهرست نسخه ها
Download citation:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
BibTeX | RIS | EndNote | Medlars | ProCite | Reference Manager | RefWorks
Send citation to:
Tirmomenin M, Ataei F, Hosseinkhani S. Cloning of human survivin in pET-28a and its protein expression study in E.coli BL21(DE3). JMBS 2020; 11 (3) :8-14
URL: http://biot.modares.ac.ir/article-22-41661-fa.html
URL: http://biot.modares.ac.ir/article-22-41661-fa.html
تیرمومنین مهسا، عطائی فرنگیس، حسین خانی سامان. کلون‌کردن ژن survivin انسانی در وکتور پروکاریوتی pET-28a و ارزیابی بیان پروتئین در باکتری E.coli BL21(DE3). زیست‌فناوری مدرس. 1399; 11 (3) :8-14
1- دانشگاه تربیت مدرس
2- دانشگاه تربیت مدرس ، ataei_fa@yahoo.com
2- دانشگاه تربیت مدرس ، ataei_fa@yahoo.com
چکیده: (4149 مشاهده)
مهارکننده آپوپتوز (IAP) یک خانواده از پروتئینها هستند که با مهار فعالیت کاسپاز مرگ سلول را متوقف میکنند. Survivin کوچکترین پروتئین شناخته شده از این خانواده است که در سلولهای سرطانی مشاهده میشود اما در بافتهای نرمال بجز بافت جنینی مشاهده نشده است. survivin ممکن است بهعنوان یک مارکر جدید برای شناسایی و درمان سرطان مورد استفاده قرار گیرد. هدف از این پژوهش، کلونینگ ژن survivin در وکتور pET-28a و بیان پروتئین در باکتری E.coli بود.
ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیمهای محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونیها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.
اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالییابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.
ژن survivin با روش PCR و با استفاده از پرایمرهای اختصاصی و الگوی pcDNA-survivin تکثیر شد. محصول PCR و پلاسمید pET-28a با آنزیمهای محدودگر HindIII/NheIبرش داده و survivin درون وکتور برش خورده الحاق شد. سپس محصول الحاق شده به باکتری E.coli DH5a ترنسفورم و با استفاده از آنتی بیوتیک کانامایسین غربالگری شد. کلونیها با روش PCR ارزیابی شده و پلاسمید کلونی مثبت با روش هضم دوگانه غربالگری شده، در نهایت یک کلونی مثبت با تعیین توالی تایید شد. پلاسمید نوترکیب با روش شیمیایی به باکتری بیانی E.coli (BL21) ترنسفورم شد. بیان survivin در شرایط مختلف انجام و سطح بیان با SDS-PAGE بررسی شد.
اندازه قطعه تکثیرشده توسط PCR با استفاده از ژل آگارز تایید شد. پلاسمید pET-28a برش خورده نیز فعالیت آنزیمی را تایید کرد. قطعه کلون شده پس از توالییابی تشابه 100% با survivin انسانی داشت. افزودن IPTG موجب بیان پروتئین survivin در تمام شرایط خصوصا در دمای 37 درجه سانتیگراد از زمان 2 ساعت پس از القا شد اما در تمام شرایط، عمده survivin بیان شده در باکتری به صورت تجمعی بود.
نوع مقاله: پژوهشی اصیل |
موضوع مقاله:
بیوتکنولوژی مولکولی
دریافت: 1399/1/9 | پذیرش: 1399/3/8 | انتشار: 1399/7/11
دریافت: 1399/1/9 | پذیرش: 1399/3/8 | انتشار: 1399/7/11
ارسال پیام به نویسنده مسئول
| بازنشر اطلاعات | |
 |
این مقاله تحت شرایط Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License قابل بازنشر است. |