بیان نوترکیب بخش C-ترمینال پروتئین Rif1 و محلول سازی آن با سارکوزیل

نوع مقاله : پژوهشی اصیل

نویسندگان

1 بخش بیوشیمی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

2 بخش نانوبیوتکنولوژی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه تربیت مدرس، تهران، ایران

چکیده
ژنوم یوکاریوتی حاوی چندین محل شروع همانندسازی می‌باشد. بررسی‌ها نشان می‌دهد که روند و ترتیب فعال شدن این منشأها با نظم خاصی صورت می‌گیرد که این فرآیند منظم را اصطلاحاَ زمانبندی همانندسازی (Replication timing) می-گویند. مطالعات اخیر نشان می‌دهد که فاکتورهای زیادی در تنظیم زمانبندی فرآیند همانندسازی نقش دارند. یکی از مهمترین این فاکتورها پروتئین متصل‌شونده به Rap1 (Rif1)، می‌باشد که نقش اساسی را در تنظیم برنامه زمانبندی همانندسازی در مخمر و یوکاریوت‌های پیشرفته‌تر ایفا می‌کند. قسمت عمده ساختار این پروتئین به صورت نامنظم بوده و این ویژگی‌ها مانع از بیان Rif1 به صورت پایدار شده و مطالعه بر روی آن را دشوار می‌کند.

هدف از مطالعه کنونی بیان نوترکیب دمین C-ترمینال پروتئین Rif1 موشی (muRif1-CTD) به صورت محلول می‌باشد. بدین منظور ژن muRif1-CTD از سازه یوکاریوتی حاوی ژن کامل Rif1 به کمک PCR استخراج و در وکتور بیانی pPAL7 که حاوی برچسب Profinity eXact بود، قرار گرفت. محلول‌سازی پروتئین با استفاده از دترجنت‌های مختلف و در مرحله بعد حذف دترجنت با استفاده از دیالیز صورت پذیرفت. به منظور اطمینان از اینکه پروتئین محلول شده دارای فعالیت است آنالیز برهمکنش پروتئین Rif1 با ساختار G4 (که قبلا در رابطه با اتصال به Rif1 معرفی شده بود) با روش ژل شیفت مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این بررسی نشان داد که استفاده از دترجنت می‌تواند برای محلول سازی پروتئین Rif1 بدون اثرگذاری بر مراحل خالص‌سازی آن مورد استفاده قرار گیرد. لیکن در مورد این پروتئین در صورت فقدان کامل دترجنت، این پروتئین به صورت محلول نخواهد بود.

کلیدواژه‌ها

موضوعات


[1]. Bedrat, Amina et al. 2014. “Thioflavin T as a Fluorescence Light-up Probe for G4 Formation.” : 1–8.
[2]. Braun, Pascal, and Josh LaBaer. 2003. “High Throughput Protein Production for Functional Proteomics.” Trends in Biotechnology 21(9): 383–88. https://doi.org/10.1016/S0167-7799(03)00189-6.
[3]. Brazda, V, R C Laister, E B Jagelska, and C Arrowsmith. 2011. “Cruciform Structures Are a Common DNA Feature Important for Regulating Biological Processes.” BMC Mol Biol 12: 33. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21816114.
[4]. Burgess, Richard. 2009. “Chapter 17 Refolding Solubilized Inclusion Body Proteins.” Methods in enzymology 463: 259–82.
[5]. Chisnall, B, C Johnson, Y Kulaberoglu, and Y W Chen. 2014. “Insoluble Protein Purification with Sarkosyl: Facts and Precautions.” Methods Mol Biol 1091: 179–86. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24203332.
[6]. Cornacchia, D et al. 2012. “Mouse Rif1 Is a Key Regulator of the Replication-Timing Programme in Mammalian Cells.” EMBO J 31(18): 3678–90. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22850673.
[7]. Fragkos, Michalis, Olivier Ganier, Philippe Coulombe, and Marcel Méchali. 2015. “DNA Replication Origin Activation in Space and Time.” Nature Reviews Molecular Cell Biology 16: 360. https://doi.org/10.1038/nrm4002.
[8]. Frankel, S, R Sohn, and L Leinwand. 1991. “The Use of Sarkosyl in Generating Soluble Protein after Bacterial Expression.” Proc Natl Acad Sci U S A 88(4): 1192–96. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1705029.
[9]. Hardy, C F, L Sussel, and D Shore. 1992. “A RAP1-Interacting Protein Involved in Transcriptional Silencing and Telomere Length Regulation.” Genes Dev 6(5): 801–14. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1577274.
[10]. Kanoh, Y et al. 2015. “Rif1 Binds to G Quadruplexes and Suppresses Replication over Long Distances.” Nat Struct Mol Biol 22(11): 889–97. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26436827.
[11]. Kumar, Manu, Seong Ryong Kim, Prabodh Chander Sharma, and Ashwani Pareek. 2015. “Simple and Efficient Way to Detect Small Polymorphic Bands in Plants.” Genomics Data 5: 218–22. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213596015001075.
[12]. Lewin, B. 2014. Lewin’s GENES XI. Jones & Bartlett Publishers.
[13]. Li, F et al. 2001. “The Replication Timing Program of the Chinese Hamster Beta-Globin Locus Is Established Coincident with Its Repositioning near Peripheral Heterochromatin in Early G1 Phase.” J Cell Biol 154(2): 283–92. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11470818.
[14]. Lilie, Hauke, Elisabeth Schwarz, and Rainer Rudolph. 1998. “Advances in Refolding of Proteins Produced in E. Coli.” Current Opinion in Biotechnology 9(5): 497–501. http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0958166998800359.
[15]. Masai, H et al. 2010. “Eukaryotic Chromosome DNA Replication: Where, When, and How?” Annu Rev Biochem 79: 89–130. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20373915.
[16]. ———. 2018. “Telomere-Binding Factors in the Regulation of DNA Replication.” Genes Genet Syst 92(3): 119–25. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28674277.
[17]. Masai, Hisao et al. 2019. “Rif1 Promotes Association of G-Quadruplex (G4) by Its Specific G4 Binding and Oligomerization Activities.” Scientific Reports 9(1): 8618. https://doi.org/10.1038/s41598-019-44736-9.
[18]. Massiah, M.A., Wright, K.M., and Du, H. 2016. “Obtaining Soluble Folded Proteins from Inclusion Bodies Using Sarkosyl, Triton X-100, and CHAPS.” In Application to LB and M9 Minimal Media., Curr. Protoc. Protein Sci., 1–6.
[19]. Massiah, Michael A, Katharine M Wright, and Haijuan Du. 2016. “Obtaining Soluble Folded Proteins from Inclusion Bodies Using Sarkosyl , Triton X-100 , and CHAPS : Application to LB and M9 Minimal Media.” : 1–24.
[20]. Mishra, Subodh Kumar et al. 2019. “Characterization of Highly Conserved G-Quadruplex Motifs as Potential Drug Targets in Streptococcus Pneumoniae.” Scientific Reports 9(1): 1791. https://doi.org/10.1038/s41598-018-38400-x.
[21]. Moriyama, K, N Yoshizawa-Sugata, and H Masai. 2018. “Oligomer Formation and G-Quadruplex Binding by Purified Murine Rif1 Protein, a Key Organizer of Higher-Order Chromatin Architecture.” J Biol Chem 293(10): 3607–24. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29348174.
[22]. Pullara, F et al. 2013. “A General Path for Large-Scale Solubilization of Cellular Proteins: From Membrane Receptors to Multiprotein Complexes.” Protein Expr Purif 87(2): 111–19. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23137940.
[23]. Renaud de la Faverie, A et al. 2014. “Thioflavin T as a Fluorescence Light-up Probe for G4 Formation.” Nucleic Acids Res 42(8): e65. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24510097.
[24]. Rosano, Germán L, and Eduardo A Ceccarelli. 2014. “Recombinant Protein Expression in Escherichia Coli: Advances and Challenges.” Frontiers in microbiology 5: 172. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24860555.
[25]. Shi, Tianlai et al. 2013. “Rif1 and Rif2 Shape Telomere Function and Architecture through Multivalent Rap1 Interactions.”
[26]. Sreesankar, E et al. 2012. “Functional Diversification of Yeast Telomere Associated Protein, Rif1, in Higher Eukaryotes.” BMC Genomics 13: 255. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22712556.
[27]. Sukackaite, R et al. 2014. “Structural and Biophysical Characterization of Murine Rif1 C Terminus Reveals High Specificity for DNA Cruciform Structures.” J Biol Chem 289(20): 13903–11. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24634216.
[28]. Tao, Hu et al. 2010. “Benchmarks Purifying Natively Folded Proteins.” : 61–63.
[29]. Xu, D et al. 2010. “Rif1 Provides a New DNA-Binding Interface for the Bloom Syndrome Complex to Maintain Normal Replication.” EMBO J 29(18): 3140–55. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20711169.
[30]. Yamazaki, S, M Hayano, and H Masai. 2013. “Replication Timing Regulation of Eukaryotic Replicons: Rif1 as a Global Regulator of Replication Timing.” Trends Genet 29(8): 449–60. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23809990.