زیست فناوری

چکیده نوروتوکسین‌های بوتولینوم، سمی ترین ترکیبات بیولوژیک شناخته­­ شده‌اند که باعث ایجاد فلج عضلانی می­شوند. خاصیت آنزیمی این توکسین‌ها، مهار آزاد­سازی میانجی عصبی استیل کولین را باعث می­شود. مطالعه حاضر با هدف تولید نوترکیب بخش کاتالیتیک (زنجیره سبک) سم بوتولینوم تیپ A با درصد خلوص بالا، به‌منظور ارزیابی فعالیت آنزیمی انجام‌شد. توالی ژن زنجیره کاتالیتیک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A از پایگاه ژنی NCBI گرفته‌شد. پس از بهینه‌سازی کدون ترجیحی ژن مورد‌ نظر برای E.­coli، توالی نهایی ژن به‌منظور سنتز در وکتور بیانی pET28a(+) سفارش داده شد. پس از انتقال وکتور بیانی نوترکیب دارای ژن مذکور به میزبان E.­coli BL21-DE3 ، فرایند بیان در شرایط استاندارد انجام شد. در ادامه تولید پروتئین مورد نظر به شکل محلول با بهینه سازی کشت میزبان و بیان پروتئین صورت پذیرفت. پروتئین بیانی به وسیله ستون Ni-NTA تخلیصو با آنتی بادی اختصاصی مورد تأیید قرار گرفت. در این تحقیق بالاترین میزان بیان به شکل محلول، در شرایط غلظت 5/0 میلی مولار IPTG، با جذب نوری 5/0 و زمان القای 18 ساعت در دمای 18 درجه سانتی گراد به‌دست آمد. آزمایش‌های وسترن بلات و الایزا، وجود پروتئین هدف را تأیید‌کردند.براساس نتایج، زنجیره سبک نوروتوکسین بوتولینوم تیپ A به شکل محلول تولید شد. فرایند تخلیص نیز با رزین تمایلی با کیفیت عالی انجام شد به طوری‌که پروتئین مورد نظر با درصد خلوص 98 به‌دست آمد.

چکیده RNAها در بسیاری از فرایندهای زیستی و پزشکی نقش حیاتی دارند و کارکرد RNA به طور مستقیم به ساختارش وابسته است. طراحی ساختارهای RNA مسئله‌‌‌‌ای اصلی در زمینه‌ی زیست‌شناسی است که دردرمان و نانوتکنولوژی اهمیت دارد. به همین دلیل الگوریتم‌‌‌‌هایی برایپیش‌گویی ساختار دوم RNA ایجاد شده است. در این مقاله الگوریتمی برایپیش‌گویی دقیق ساختار دوم RNA بر اساس کمترین میزان انرژی آزاد و بیشترین تعداد جفت‌‌‌‌بازهای مجاورارائه می‌‌‌‌دهیم. این الگوریتم برپایه‌‌‌‌ی روش اکتشافی است که از یک ماتریسنقطه‌‌‌‌ایبرای نشان‌‌‌‌دادن همه‌ی جفت­بازهای ممکنRNAاستفاده می‌‌‌‌کند. سپس استم‌‌‌‌ها¹ از ماتریس‌‌‌‌نقطه‌‌‌‌ای استخراج می‌‌‌‌شوند و براساس طولشان به ترتیب نزولی و سپس استم‌‌‌‌های با طول برابر براساسمیزان انرژی آزاد به ترتیب صعودی مرتب می‌شوند. سرانجام استم‌‌‌‌ها به‌ترتیب برای تشکیل ساختار دوم انتخاب می‌‌‌‌شوند. الگوریتم پیشنهادی روی تعدادی از داده‌‌‌‌ها از جمله CopA، CopT، R1inv، R2inv، Tar، Tar*، DIS، IncRNA₅₄ و RepZ در باکتر‌‌‌‌ی‌‌‌‌ها اجرا می‌‌‌‌گردد. نتایج آزمایش‌ها دقت بالای الگوریتم پیشنهادی را که 71/95 درصد است، نشان می‌‌‌‌دهد. این الگوریتم در زمانکمتری نسبت به سایر روش‌ها اجرامی‌شود.

چکیده ا امروزه یکیاز اهداف اصلی صنایع تولیدکننده‌‌ آنزیم‌‌ها،پایدارسازی این ملکول‌‌ها بدون کاهشفعالیتآن‌هااست. اسمولیت‌‌های پایدارکننده نوعی افزودنی است که کاربرد گسترده درافزایش پایداری آنزیم‌‌هادارد وبدونایجاد تغییرات مخرب در ساختمان آنزیم،‌‌سبب افزایش پایداری آن می‌‌شود. تاکنون پژوهشات زیادی برای بررسی سازوکار اسمولیت‌‌ها انجام شده است ولی جزئیات سازوکار آن‌ها هنوز مشخص نشده است.در این پژوهش اثرهم‌زمان دو اسمولیت پایدارکننده سوربیتول و ترهالوزبر فعالیت و پایداری ساختار آنزیم لیپاز سودوموناس سپاسیابا روش‌های طیف‌‌سنجی فرابنفش-مرئی، فلورسانس و دورنگ‌‌نمایی دورانی بررسی شده است. برای بررسی دقیق‌‌تر سازوکار اثر هم‌زماناین دو اسمولیت برساختارآنزیم و حلال مجاور آن، برای اولین بار تغییرات ضریب شکست و ضریب دی‌‌الکتریک حلال با روشتشدید پلاسمون‌‌های سطحی(SPR) نانو ذرات طلا مطالعه شده و سپس این نتایج با اثر جداگانه هر کدام از اسمولیت‌‌ها مقایسه شده است. نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که اسمولیت‌‌های ترهالوز و سوربیتول،فعالیت آنزیم را افزایش می‌‌دهند؛ در حالی که تأثیر هم‌زمان دو اسمولیت بر فعالیت آنزیم، بیشتر از اثرجداگانه هر یک از آن‌هااست. اسمولیت‌‌ها همچنین سبب افزایش محتوای ساختار دوم آنزیم می‌‌شوند. از طرفی نتایج بررسی طیف SPR نانوذرات طلا در حضور این دو اسمولیت نشان داد که ضریب دی‌‌الکتریک محیط اطراف نانو ذرات طلا،با این دواسمولیت دچار تغییرات محسوسی نمی‌‌شود. این نتایج بیانگر اثر تعاونی هر دو اسمولیت در حضور یک‌دیگر برای افزایش فعالیت و پایداری ساختاری آنزیم است.

چکیده در روش‌های بیولوژیک از میکروارگانیسم‌ها مانند باکتری‌ها، قارچ‌ها، اکتینومیست‌ها و مخمر‌ها برای تولید نانوذرات فلزی استفاده می‌شود. قارچ‌ها با ترشح آنزیم‌ها به مقدار زیاد، انتخاب مناسبی برای ساخت زیستی نانوذرات نقره است. هدف این پژوهش، تولید زیستی نانوذرات نقرهبه‌وسیله‌ی قارچ‌های جنس پنی‌سیلیومجداشده از معدن سرب و روی زنجان است. پس از کشت اولیه، رشد کلونی‌ها و جداسازی قارچ‌های جنس پنی‌سیلیوم، 15 گرم از بیومس قارچی در محلول حاوی نیترات نقره‌ی1 میلی‌مولار، 72 ساعت انکوبه شد. تولید نانوذرات نقره با استفاده از اسپکتروفتومتری UV-vis، آزمایش پراش اشعه ایکس(XRD) و میکروسکوپ الکترونی عبوری(TEM) بررسی شد. بین 16 نوع قارچ جداشده، 6 نوع قارچ پنی‌سیلیوم تشخیص داده شد که از بین آن‌ها تنها قارچ پنی‌سیلیوم بروی کامپاکتوم (Penicilliumbrevicompactum)توانایی ساخت نانوذرات نقره را داشت. تغییر رنگ محلول‌های واکنش، از بی‌رنگ به قهوه‌ای مایل به زرد، وجود بیشینه‌ی جذب در بازه‌ی طول موجی 425-406 نانومتر و ظهور پیکدر نقاط (111)، (200)، (220) و (311) در روش پراش اشعهX ، تولید نانوذرات نقره را تأیید کردند. در نهایت، تصاویر TEM نشان دادند که نانوذرات نقره بیشتر در خارج سلول در سطح میسلیوم‌ها، در اندازه‌ی 100-50 نانومتر و به شکل کروی تولید شده است. آزمایش‌های اسلاید کالچر، رشدروی آگار مخمر czapek و آگار کراتین سوکروز، نشان دادند که این قارچ، پنی‌سیلیوم بروی کامپاکتوم است.

چکیده در آنزیم α -آمیلاز (BAA)B. amyloliquefaciens ، رزیدیوهای 185 – 177 (ناحیه I یا لوپ) سازنده بخشی از محفظة‌ (Cage) مسئول اتصال به کلسیم هستند. لوپ موجود در BAA دارای دو رزیدیو بیشتر از همتای ترموفیل خود یعنی α -آمیلاز (BLA) B. licheniformis می‌باشد و رزیدیوی Arg176 موجود در این بخش با Glu126 از ناحیة‌ II (رزیدیوهای 131 – 118) ایجاد یک پل نمکی می‌کند که این ارتباط در آنزیم BLA به واسطه جایگزینی‌های R176Q، E126V حذف گردیده است و از سویی پایداری حرارتی آنزیم BAA به میزان زیادی به یون کلسیم وابسته است. در این تحقیق، اثر پل نمکی در پایداری حرارتی آنزیم بررسی گردید و برای مشخص شدن اهمیت ساختاری و عملکردی پل نمکی مذکور، ابتدا مدل مولکولی آنزیم ΔE126 به طریقه تئوری ساخته شد و در ادامه موقعیت و اثرات رزیدیوهای دو منطقه I و II از طریق برنامه‌های GETAREA و WHAT IF مورد بررسی قرار گرفت و سپس جهش فوق به وسیله جهش‌زایی هدفمند در ژن BAA ایجاد شد و پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته و وحشی با یکدیگر مقایسه گردید. نتایج حاصل از مدل مولکولی نشان داد که حذف پل نمکی از طریق اثر بر رزیدیوهای آبدوست و آبگریز موجود در دو منطقه I و II باعث افزایش نفوذ پذیری آنزیم به آب می‌گردد ونا پایداری حرارتی آنزیم جهش یافته نیز نتایج فوق را تأیید کرد. بنابراین وجود پل نمکی از طریق کاهش نفوذپذیری آنزیم به آب، مانع خروج کلسیم و غیرفعال شدن حرارتی آنزیم می‌گردد.

چکیده برای درمان بیماری‌های ایسکمیک، سلول‌درمانی به‌عنوان روشی جدید و مؤثر مطرح است. سلول‌های بنیادی مزانشیمی به دلایل مختلف مانند امکان جداسازی و تکثیر آسان بدون ازدست دادن توانایی تمایزی و تنظیم سامانه ایمنی جایگاه ویژه‌ای دارند. سلول‌های بنیادی پس از تزریق در بافت‌های ایسکمیک با شرایط سخت کمبود اکسیژن رو به رو می‌شوند که با مرگ بیشتر سلول‌ها همراه است. به همین دلیل کارایی سلول درمانی بسیار کاهش می‌یابد. همچنین سرنوشت این سلول‌ها از نظر زنده ماندن و تمایز مورد بحث است. در مطالعات متعددی تأثیر مفید پیش‌آماده‌سازی سلول‌ها با هیپوکسی برای سلول درمانی بافت‌های ایسکمیک گزارش شده است و تنظیم‌کننده‌ی اصلی در این فرایند، فاکتور رونویسی HIF-1α است. در این پژوهش، ژن HIF-1α با استفاده از لنتی‌ویروس‌ها به سلول‌های بنیادی مزانشیمی منتقل می‌شود تا با افزایش بیان آن، شرایط پیش‌آماده‌سازی با هیپوکسی، شبیه‌سازی شود. از طرفی پروتئین eGFP نیز به صورت Bisictronic همراه HIF-1α بیان می‌شود. به این ترتیب هم می‌توان اثر شبیه‌سازی پیش‌آماده‌سازی هیپوکسی روی سلول‌های بنیادی مزانشیمی را بررسی کرد و هم پیگیری و بررسی سرنوشت سلول‌های تزریق‌شده در مدل‌های حیوانی با استفاده از مارکر GFP،انجام می‌شود.

چکیده با‌توجه به تفاوت‌ فاحش، در تعداد پروتیین‌های گزارش شده در نمایۀ دوبعدی پروتئوم اشک (97 تا 250 پروتیین)، و همچنین با در‌نظر‌گرفتن ناهمگون بودن محتوای پروتیینی این نمونه، تصور بر‌آن است که عدم انحلال صحیح، عاملی مهم در ناکارآمدی بررسی‌های الکتروفورتیک اشک‌ باشد. بدیهی‌است که دستیابی به الگوی جداسازی مطلوب تنها در سایۀ حفظ حالت محلول پروتیین‌ها و جلوگیری از رسوب آن‌ها در مراحل مختلف، حاصل‌می‌گردد. متاسفانه علی‌رغم اینکه با افزایش برهمکنش‌های آبگریز، بین پروتیین‌های آلیفاتیک در نقطۀ ایزوالکتریک، احتمال رسوب پروتیین‌ها در ماتریکس ژل افزایش‌می‌یابد، به‌دلیل لزوم حفظ بار طبیعی پروتیین در بعد اول جداسازی، استفاده از شوینده‌های قوی یونی در این مرحله مجاز نمی‌باشد. در این‌جا با هدف افزایش تعداد پروتیین‌ها در نمایۀ دوبعدی، تأثیر کائوتروپ‌ها، شوینده‌های دو‌یونی خنثی، خنثی و بدون‌بار و باردار در انحلال‌پذیری پروتئوم اشک، در فرآیند متمرکز‌نمودن ایزوالکتریکی مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان‌دهندۀ از‌دست رفتن پروتیین‌ها در مراحل مختلف به‌واسطۀ رسوب در ماتریکس ژل و یا عدم بازگشت به فاز محلول در زمان آماده‌سازی و انحلال رسوب است. این بررسی همچنین نشان می‌دهد که شوینده‌های بدون بار همچون Triton‌X-100 و Tween‌80 در رفع این مشکل کاملا ناموفق هستند. شوینده‌های دو‌یونی خنثی همچون CHAPS و SB‌3-10 توانایی بیشتری برای حل محتوای هیدروفوب پروتیین‌های اشک داشته و الگوی مناسب‌تری را ارائه می‌دهند. در‌نهایت بیشترین میزان انحلال‌پذیری و بهترین الگوی جداسازی می‌تواند با استفاده از مخلوط اوره و تیوره در بافر بارگزاری و اعمال شویندۀ آنیونی SDS در مرحلۀ آماده‌سازی (با پروتکل ویژه‌ای که حذف کامل SDS و جایگزینی آن با CHAPS را تضمین کند) حاصل‌شود.

چکیده پ پاپایین (2.22.4.3EC)، سیستئین پروتئازی با فعالیت کاتالیزوری قابل‌توجه است که امروزه کاربرد گسترده در صنایع دارد. استفاده از پاپایین تثبیت‌شده در بسیاری از فرایندها، مزایایی ارزشمند دارد و در برخی موارد ضروری است. از سیستئین بیشتر برای دست‌یابی به فعالیت مناسب، به عنوان فعال‌کننده پاپایین استفاده می‌شود. از طرفی، برخی از یون‌های دوظرفیتی مانندCa²⁺ به عنوان مهارکننده این آنزیم عمل می‌کنند. در این پژوهش پس از فعال کردن ژل سفارز6B به‌وسیله‌ی سیانوژن برومید، برای اتصال کووالان آنزیم، محلول پروتئینی با غلظت mg/ml 5 به ژل فعال اضافه شد. برای مسدودکردن گروه‌‌های فعال آزاد روی ژل که پس از اضافه شدن آنزیم با آن واکنش نداده بودند، از محلول M2 گلیسین استفاده شد. نتایج نشان داد که تثبیت آنزیم روی این بستر موجب پایداری نسبت به زمان، دما، pH‌های بحرانی و همچنین افزایش مقاومت در برابر اثر مهارکنندگی یون‌‌های دوظرفیتی می­شد. دمای بهینه آنزیم تثبیت‌شدهC °20 (از 60 به C°80) از آنزیم آزاد بیشتر بود و pH بهینه نیز از 7 به 8 رسید. شاخص‌های سینتیکی آنزیم (K_m و k_cat) نیز هنگام تثبیت دچار تغییر شدند. این نتیجه بسیار اهمیت دارد به ویژه اگر بدانیم که تثبیت آنزیم‌ها موجب کاهش فعالیت و کارایی کاتالیتیک آن‌ها می‌‌شود.